首次！中南大學(xué)湘雅醫(yī)院團隊最新研究發(fā)布

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作者：Sophia

導(dǎo)讀：線粒體細胞凋亡由BCL-2家族蛋白通過微妙的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)嚴格控制。腫瘤抑制蛋白p53通過與BCL-2家族蛋白的直接相互作用觸發(fā)轉(zhuǎn)錄非依賴性細胞凋亡，但其分子機制尚不清楚。

(資料圖片僅供參考)

近日，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院國家衛(wèi)健委腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室/抗癌藥物國家地方聯(lián)合工程實驗室陳永恒教授團隊在《Nature Communications》上發(fā)表題為“Structures of p53/BCL-2 complex suggest a mechanism for p53 to antagonize BCL-2 activity”的原創(chuàng)性研究論文。該研究不僅首次闡明了p53結(jié)合抗凋亡蛋白BCL-2的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，還首次揭示了p53通過競爭性抑制BCL-2與其家族促凋亡蛋白相互作用，以轉(zhuǎn)錄非依賴性方式促進細胞凋亡的新機制。

研究背景

01

細胞凋亡失調(diào)在腫瘤發(fā)生和耐藥性中已被廣泛描述，激活癌細胞凋亡是臨床腫瘤學(xué)的主要目標。BCL-2家族蛋白和腫瘤抑制蛋白p53是細胞凋亡信號通路中的中樞調(diào)節(jié)因子。p53通過轉(zhuǎn)錄依賴性途徑調(diào)節(jié)BCL-2家族的活性。作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，p53轉(zhuǎn)錄激活促凋亡基因的表達，如NOXA、Bax和Puma7。在細胞質(zhì)和線粒體膜中，p53還通過與抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL8形成抑制復(fù)合物或通過激活促凋亡效應(yīng)蛋白Bak和Bax來觸發(fā)細胞凋亡。

促凋亡和抗凋亡BCL-2家族蛋白通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)嚴格控制線粒體凋亡途徑（也稱為內(nèi)在細胞凋亡途徑）。Bak和Bax直接控制線粒體外膜（OMM）的完整性和細胞凋亡的啟動。響應(yīng)凋亡刺激，Bak和Bax直接或間接地被促凋亡的BH3激活劑或敏化劑激活，并在OMM上形成孔，這導(dǎo)致細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中并激活半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)。然而，抗凋亡BCL-2蛋白通過大的疏水口袋（稱為BH3結(jié)合口袋）規(guī)范結(jié)合并隔離促凋亡蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域，從而拮抗促凋亡蛋白的活性。這種規(guī)范的相互作用機制促進了BH3模擬藥物的開發(fā)，BH3模擬藥物通過競爭性占據(jù)BH3結(jié)合口袋選擇性地抑制抗凋亡BCL-2成員。

p53在預(yù)防癌癥發(fā)展方面起著至關(guān)重要的作用。在大約 50% 的人類癌癥中，p53 功能被基因突變消除。p53與抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的直接相互作用在p53介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中具有重要作用。p53的活性取決于其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（p53-DBD）。p53-DBD在與BH3結(jié)合口袋不同的表面上結(jié)合BCL-xL，如NMR和晶體結(jié)構(gòu)研究所證明的那樣。我們先前的p53-DBD/BCL-xL配合物晶體結(jié)構(gòu)表明，p53-DBD形成同源二聚體，并在由α1和α5的C端殘基、α5-α6環(huán)和α3-α4環(huán)組成的表面上與BCL-xL結(jié)合21。BCL-2和BCL-xL具有45%的序列同一性，而它們對與促凋亡蛋白的相互作用具有不同的敏感性。

研究進展

02

人 p53 是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，由 N 端反式活化結(jié)構(gòu)域（NTD，殘基 1-92）、與四聚化結(jié)構(gòu)域（TET，殘基 96-292）相連的核心 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD，殘基 324-356）和 C 末端結(jié)構(gòu)域（CTD，殘基 364-393）組成。DBD 是負責綁定 BCL-2 的主域。人類BCL-2包含四個BCL-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4）和一個C端跨膜結(jié)構(gòu)域。

p53-DBD/BCL-2配合物的晶體結(jié)構(gòu)

為了研究p53和BCL-2之間的相互作用，我們進行了晶體學(xué)結(jié)構(gòu)分析。通過將p53-DBD與BCL-2蛋白混合來結(jié)晶p53-DBD / BCL-2復(fù)合物的初步試驗失敗了。為了穩(wěn)定p53-DBD/BCL-2復(fù)合物，我們使用了融合策略。

首先，BCL-2通過富含甘氨酸的接頭與p53-DBD連接，該接頭以前用于p53-DBD / BCL-xL復(fù)合物以增加兩種蛋白質(zhì)之間的接近度。然而，我們注意到BCL-2構(gòu)建體（BCL-2#3）具有縮短的α1-α2環(huán)和某些表面殘基被BCL-xL序列取代，可以高產(chǎn)率表達，適合結(jié)晶。據(jù)報道，BCL-2#3對僅BH3肽的選擇性特征與野生型BCL-2相似，并且與BCL-xL特異性肽Hrk的相互作用較弱。截斷策略已用于BCL-2家族的許多生化和結(jié)構(gòu)研究，例如BCL-2#2用于BCL-2溶液NMR，BCL-2 / Bax-BH3和BCL-2 / venetoclax的晶體結(jié)構(gòu)， BCL-2#3用于BCL-2/美洲獅-BH3等晶體結(jié)構(gòu)。為了提高結(jié)晶的成功率并確保接頭不會影響蛋白質(zhì)相互作用，我們通過三種不同的富含甘氨酸的接頭將該BCL-2#3構(gòu)建體連接到p53-DBD。凝膠過濾色譜分析表明融合蛋白高度均一。此外，微量熱泳（MST）測定表明，p53-DBD對BCL-2（3.5μM）和BCL-2#3（3.9μM）具有相似的KD值，表明BCL-2的修飾不影響其與p53-DBD的結(jié)合親和力。

在這些結(jié)晶嘗試中，BCL-2融合蛋白可以獲得小的針狀晶體，但很難針對X射線衍射優(yōu)化它們。特別是，三種BCL-2#3-接頭-p53-DBD融合蛋白的晶體成功地針對X射線衍射進行了優(yōu)化，并在P 21 21 21空間組中以2.3-2.7 ?的分辨率測定。這三種結(jié)構(gòu)疊加的RMSD為0.2–0.5 ?。p53-DBD和BCL-2#3在3種結(jié)構(gòu)中具有相似的相互作用模式，表明接頭不影響復(fù)雜結(jié)構(gòu)。此后，我們使用22個殘基連接的復(fù)合結(jié)構(gòu)作為詳細分析的代表結(jié)構(gòu)。在p53-DBD/BCL-2#3復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，p53-DBD分子與p53-DBD（PDB：2OCJ）30的apo結(jié)構(gòu)具有相似的整體結(jié)構(gòu)，RMSD為0.4?。p53的兩個環(huán)，連接鏈S5和S6的環(huán)（S5-S6環(huán)）和大環(huán)L2，插入由BH1-3結(jié)構(gòu)域組成的BCL-2#3的BH3結(jié)合口袋中。BCL-2#3的整體結(jié)構(gòu)與BCL-2的apo溶液結(jié)構(gòu)非常相似（PDB：1GJH）26，α3和α4區(qū)域以及α2和α5的C末端有小的構(gòu)象變化。值得注意的是，BCL-2的柔性環(huán)和改性殘基不位于與p53-DBD的接觸表面上。這表明BCL-2的修飾對復(fù)雜結(jié)構(gòu)的影響最小。

研究意義

03

總之，我們的研究闡明了p53/BCL-2相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并揭示了p53通過直接占據(jù)BH2結(jié)合口袋并釋放螯合在口袋中的促凋亡BCL-3家族蛋白來拮抗BCL-2活性的分子機制。這些結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)為p53介導(dǎo)的線粒體細胞凋亡的復(fù)雜調(diào)控機制提供了見解。

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