誰是“元兇”——結節性硬化病變溯源 | 腦科學科普專欄35期

【腦科學科普】專欄

第035期

# 腦海Yeah 第 43 期 #

文 | 周誠爾

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案件背景——關于結節性硬化

結節性硬化（Tuberous Sclerosis Complex, TSC）是一種常染色體顯性遺傳、多系統累及（圖1）的疾病[1]，臨床表現主要有驚厥發作、自閉癥譜系障礙、智力障礙等。其主要致病基因是位于9號染色體上的TSC1基因或位于16號染色體上的TSC2基因[2]。

圖 1 結節性硬化的臨床表現

本次推理任務：

尋找導致結節性硬化腦部病理改變的“真兇“

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梳理“時間線”，發現矛盾點

既往基于小鼠模型的研究中，結節性硬化的發病是TSC1或TSC2的一個等位基因已經失活（TSC+/-）的基礎上，發生第二個等位基因的失活(TSC-/-)，即“二次打擊”學說（圖2）。依照該邏輯，第二個等位基因失活在前，結節性硬化的特征性病變在后。

圖 2 既往的“二次打擊”學說

然而，患者的基因分析顯示，大多數的腫瘤樣本中可發現第二個等位基因的缺失突變，而在皮質結節樣本中，這樣的純合缺失突變并不多——這挑戰了以往的“二次打擊”模型。

機智的研究人員就此假設，小鼠模型與患者病理的不一致或許是由于人腦特有的細胞類型在疾病的發生發展過程中起到了關鍵性的作用。

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探案新工具——構建結節性硬化大腦類器官模型

圖 3 結節性硬化大腦類器官模型構建

研究團隊將結節性硬化患者外周血單核細胞/PBMCs重編程為誘導多能干細胞/iPSCs，再于不同營養環境中生成類器官（圖3）。其中一名患者由于是嵌合體，可構建TSC2+/-和TSC2+/+(對照組)兩種類器官，而另一名TSC2+/-患者除了構建TSC2+/-類器官外，也通過CRISPER-Cas9修復構建TSC2+/+(對照組)類器官。

經過相應的染色驗證，TSC+/-類器官可以概括結節性硬化患者腦部的主要組織病理變化（圖4）。如圖3B所示，低營養環境中類器官傾向于形成結節樣結構，高營養環境中類器官傾向于形成腫瘤樣結構。

圖 4 患者來源的TSC2+/-類器官與對照組類器官之間腫瘤和結節病變情況對比

研究團隊接著對在高營養培養基中培養220天的類器官進行染色，發現培養到這個時間段，類器官中基本都是腫瘤組織。接著，他們利用UMAP（一種非線性降維的算法）揭示了在TSC2+/-患者來源的高營養類器官中主要是中間神經元、中間神經元祖細胞、分裂中的中間神經元祖細胞3個群組，興奮性神經元只占很小一部分（圖5A）。并且圖5A中3個主要群組的細胞在9個腫瘤區域中分布均勻（圖5B），這說明這樣的細胞構成分布情況在腫瘤中相對普適，較為可靠。

圖 5

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聚焦疑點

問

兩個等位基因均失活是否是腫瘤發生的必要條件？

答

并不是。

圖 6 雜合突變、純合突變的腫瘤均存在

雜合突變的腫瘤中未發現基因重組，失去雜合性（Loss of Heterozygosity, LOH）的腫瘤是以拷貝數不變（copy-neutral，cn）的形式實現的。

那么既然TSC類器官中腫瘤形成不是必須通過cnLOH，研究人員假設或許是TSC1/2蛋白表達量少，導致中間神經元祖細胞進一步減少TSC1/TSC2蛋白表達量。熒光免疫染色顯示，在EGFR+的中間神經元祖細胞中，無論是對照組類器官，還是TSC2+/-類器官，其TSC2表達量均有減少。雖然在對照組類器官中，TSC1和TSC2的表達量在EGFR+細胞中都有下降，在TSC腫瘤細胞中，TSC2一個等位基因的突變導致了尤其明顯的TSC2表達量減少（圖7）。

圖 7 TSC表達量

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鎖定“元兇”

220天的TSC腫瘤類器官中，尾側神經節隆起/CGE相關（圖8A）的細胞占比最高（圖8B），且在110天類器官中，高營養和低營養環境的TSC+/-類器官與對照組相比，CGE相關的細胞均更多。

圖 8

此外，根據單細胞軌跡分析的結果，腫瘤和結節類器官有著CGE祖細胞到CGE中間神經元的共同軌跡（圖9），而這與在人類胚胎大腦中的觀察結果一致。

圖 9

至此，相關證據表明，擴增的CGE祖細胞在妊娠中期的較晚階段出現，此時恰好是皮質結節和室管膜下腫瘤在TSC患者中開始出現的時刻。基于CGE來源和較晚出現兩大特征，研究人員將這些細胞命名為尾端遲現中間神經元祖細胞/caudal late interneuron progenitor cells/CLIP cells。

一系列染色結果表明， TSC腫瘤類器官中的神經祖細胞主要是CLIP細胞（圖10）。這也可以解釋，室管膜下結節/室管膜下巨細胞性星形細胞瘤的分布位置為何總在尾側丘腦溝/caudothalamic groove。相似地，在TSC結節類器官中，巨型細胞表達CLIP細胞標記物、CGE標記物說明了其CLIP細胞的來源（圖11）。

圖 10 染色結果之一：EDNRB在腫瘤類器官及成人患者SEGA樣本中均有表達

圖 11 染色結果之一：EDNRB在類器官的GCs及胎兒結節病灶中均有表達

總結

讓我們先把這位導致結節性硬化腫瘤和結節病變的“元兇”——CLIP細胞關進籠子。

CLIP是否是真兇呢？基于現有的證據，我們有理由認為是。它利用既往不夠敏銳的探案工具——動物模型，將自己藏匿于“拷貝數不變的雜合性喪失/cnLOH“這種現象的背后。而現在我們知道了，cnLOH雖然出現在腫瘤發展過程中，但并不是其真正的起因。

本次案件的偵破也提示我們，要捉拿“真兇”，良好的探案工具很關鍵，即利用人類模型如類器官去揭示疾病機制的必要性。

參考文獻

[1] HENSKE, E.P., S. JOZWIAK, J.C. KINGSWOOD, et al., Tuberous sclerosis complex[J]. Nat Rev Dis Primers, 2016. 2: 16035.

[2] CATLETT, T.S., M.M. ONESTO, A.J. MCCANN, et al., RHOA signaling defects result in impaired axon guidance in iPSC-derived neurons from patients with tuberous sclerosis complex[J]. Nat Commun, 2021. 12(1): 2589.

[3] EICHMULLER, O.L., N.S. CORSINI, A. VERTESY, et al., Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects[J]. Science, 2022. 375(6579): eabf5546.（本文原文）

腦科學轉化研究院

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標簽： 結節性硬化 中間神經